EDF

DIC

normalizacja

polaryzacja

ciemne tło

barwy dopełniające

światło padające

Stosowane techniki mikroskopowe

DIC - kontrast interferencyjno-różniczkowy; w zależności od mikroskopu:
dla PZO jest używany układ UPI cechujący się m. innymi bogatą paletą interferencyjnej barwy tła i dużą plastycznością obrazu
dla Nikon użyty ich system Nomarskiego, monochromatyczny lub z płytką λ dla barwnego tła interferencyjnego (DIC+λ)

uwaga! kontrast interferencyjno-różniczkowy jest mało użyteczny lub wręcz utrudnia interpretację w przypadku obiektów gęstych optycznych (wybarwionych, dobrze widocznych w technice jasnego tła);
dla mikrokryształków substancji porostowych efekt jest podobny jak przy polaryzacji "tylko lepiej" (choć nie w każdym przypadku), bo zwykle można uzyskać czytelniejszy obraz bez nadmiernego kontrastu jasności;
klasycznym obszarem obserwacji w DIC są obiekty o niskiej gęstości optycznej - niebarwione preparaty (zwłaszcza przyżyciowe) grzybów, pierwotniaków, komórek zwierzęcych

w świetle spolaryzowanym - obraz w świetle spolaryzowanym przepuszczonym powyżej obiektu przez analizator; w praktyce nie zawsze stosuje się pełne wygaszenie tła, bo kontrast może być zbyt duży lub zanikają istotne elementy nie zmieniające polaryzacji; przydatne np. dla lepszego dostrzeżenia żebra w listkach mszaków lub dla zwiększenia kontrastu obrazu kryształków substancji porostowych

ciemne tło, ciemne pole - technika obserwacji mikroskopowej w świetle przechodzącym, gdy obiekt jest oświetlony z użyciem centralnej przysłony "wydrążonym stożkiem światła" wychodzącego z kondensora w taki sposób, że nie wpada ono bezpośrednio do obiektywu, lecz dociera tam jedynie światło załamane i rozproszone na elementach obiektu. W ten sposób "świecą" na ciemnym tle, z dużym kontrastem, wszelkie, nawet drobniejsze niż maksymalna teoretyczna rozdzielczość optyczna układu (<0.22µm) elementy obiektu (i niestety silnie świecą także najdrobniejsze zanieczyszczenia szkiełek i preparatu, także znajdujące się poza płaszczyzną ostrości).
często w ciemnym polu dobrze są widoczne struktury o niskim kontraście w typowej technice jasnego tła/pola

światło padające - technika obserwacji mikroskopowej w której obiekt jest oświetlony przez światło padające na jego obserwowaną powierzchnię; tak zwykle oświetla się obiekty oglądane przez mikroskop stereoskopowy (preparacyjny); oświetlenie padające może być realizowane na nieskończoną liczbę sposobów (z różnymi efektami - patrz podręczniki oświetlenia w studio fotograficznym lub teatralnego): jako ±punktowe skośne i jednostronne do wielopunktowego i/lub mniej lub bardziej równomiernego w obszarze "sfery nieboskłonu" z punktu widzenia obiektu; w praktyce mikrofotograficznej o ograniczonej użyteczności z uwagi na nikłą głębię ostrości (pomocne mogą być tu techniki EDF), zwykle brak kontroli nad aperturą obiektywu oraz narastające z powiększeniem aberacje optyczne;
w przypadku dużych powiększeń (obiektywy mikroskopowe x2 - x5) lepsze efekty (mniejsze cienie i artefakty dyfrakcyjne) daje możliwie równomierne oświetlenie z każdej strony obiektu;
pewną odmianą techniki światła padającego jest oświetlenie epi ("od góry") gdy oświetlenie obiektu jest realizowane przez obiektyw obserwacyjny

Manipulacje obrazem

EDF (Extended Field Depth) - komputerowa technika łączenia N obrazów ("warstw") zebranych w osi Z; algorytm wyszukuje "ostre" fragmenty z każdej warstwy i włącza je do wynikowego obrazu; uzyskuje się większą niż na to pozwala fizyka "głębię ostrości obrazu"; ale uwaga! należy być ostrożnym przy interpretacji takich obrazów, bo przy tej operacji w obrazie mogą powstawać mniejsze lub większe artefakty (przekłamania, zniekształcenia); jest sporo programów darmowym lub nie oraz algorytmów realizujących sklejanie warstw; EDF dla ilustracji w tym atlasie jest realizowane w NIS-Elements

sklejanie obrazów (Large Image Stitching) - łączenie kilku fotografii aby pokazać cały obiekt "nie mieszczący się w kadrze"

jednobarwny - w przypadku tu prezentowanych zdjęć redukcja barwnego obrazu trójkanałowego (czerwony, zielony, niebieski) do skali szarości (greyscale); wykonywane przeważnie w NIS-Elements

barwy dopełniające - negatyw obrazu barwnego, niekiedy polepsza kontrast percepcyjny

negatyw - jak wyżej ale dla obrazu monochromatycznego ("grayscale")

normalizacja - różne techniki zwiększenia kontrastu obrazu przez: niekoniecznie liniowe "rozciągnięcie" wartości jasności w poszczególnych kanałach tak aby ± zawierały się w pełnym przedziale (dla 8 bitowych obrazów od 0 do 255), wprowadzenie "korekcji Gamma" i innych na histogramie jasności; zasadniczo w mniejszym lub większych stopniu dotyczy to wszystkich zdjęć mikroskopowych; w przypadku zdjęć wykonywanych mikroskopem PZO nie jest to zaznaczone w podpisie

"radial shift" - redukcja efektu aberacji chromatycznej obiektywu polegająca na promienistym pomniejszeniu lub powiększeniu obrazu składowej czerwonej i niebieskiej i nałożeniu na siebie; wykonywane dla niektórych fotografii z mikroskopu PZO, zwłaszcza z użyciem "silniejszych" obiektywów; nie zaznaczone w podpisie zdjęcia, ale zwykle ujawnia się jako ramka odmiennej barwy przy krawędziach kadru

Hoyer (medium)

Ptilidium ciliare (rzęsiak pospolity)
prześwietlony listek w medium Hoyer'a po ok. 2 miesiącach
Ptilidium ciliare (rzęsiak pospolity)
listek w wodzie; treść komórek zaciemnia obraz XL
W nielicznych przypadkach efekt "prześwietlający" może być zbyt silny np. młode, delikatne listki wątrobowców. Wtedy obserwację i fotografię należy wykonać na początkowym, optymalnym, stadium prześwietlania, gdy cytoplazma uległa zniszczeniu a ściany komórkowe są jeszcze ciemne, lub użyć technik kontrastu optycznego (DIC, polaryzacja, ciemne pole, kontrast fazowy) gdzie znikoma gęstość optyczna jest zaletą. Efekt "anihilacji optycznej" może też być korzystny. Np. w powyższym przykładzie doprowadził do niemal zupełnego "wyparowania" przyczepionych komórek glonów i resztek organicznych.
Standardowy odczynnik stosowany do zamykania preparatów mikroskopowych z mszaków celem uzyskania (prawie) trwałych preparatów mikroskopowych. Cenną właściwością jest "prześwietlanie" zamkniętych w nim obiektów tj. z upływem czasu następuje zniszczenie zawartości komórek (szybko) i zmniejszenie gęstości optycznej ścian komórkowych (wolniej).

Garść uwag praktycznych ±bardziej właściwych dla pracy z tym medium i gdy końcowym celem jest wykonanie mikrofotografii:
(wszystkie operacje wykonuje się pod mikroskopem stereoskopowym)

  • oderwane listki, o ile mają przy wysychaniu skłonność do zwijania lub są wiotkie, nie należy umieszczać bezpośrednio w tym medium, lecz po wykonaniu preparatu w kropli wody i nakryciu go szkiełkiem, wprowadzać medium od boków szkiełka nakrywkowego; przy sztywniejszych obiektach można (preparowany w wodzie preparat tj. zwykle oderwane listki) przekładać do kropli medium, w ten sposób rozcieńczanym wodą z preparacji; a całą operację, do przykrycia szkiełkiem, wykonywać stosunkowo szybko
  • do podawania medium Hoyer'a na szkiełko przedmiotowe dobrze sprawdza się plastikowa 1ml pipeta Pasteur'a; perfekcjoniści dla zabezpieczenia przed zasychaniem otworu wylotowego mogą użyć kapturka wykonanego np. z odciętej i zatopionej na końcu końcówki innej pipety
  • oczywiście należy dążyć do tego aby od początku nie było pęcherzyków powietrza; jednak bez paranoi - gdy są drobne i nieliczne lub w świetle komórek, to większość takich potrafi przez rozpuszczenie gazów w medium i dyfuzję, zaniknąć w ciągu kilku dni, tygodni
  • przed uszczelnieniem preparatu medium powinno zgęstnieć (wysychanie) co zajmuje, w zależności od grubości preparatu od kilku dni do kilku tygodni; dobrym pojemnikiem na ten czas jest teczka na preparaty mikroskopowe lub niezbyt szczelnie przykryta szalka Petriego fi. ≥10cm
  • przy b. grubych preparatach (typu całe łodyżki) przydatne bywa dociśnięcie szkiełka - sprawdzają się nakrętki dla śrub np. fi. 9-12mm
  • w przypadku b. cienkich preparatów ubytek medium w czasie wysychania zwykle nie powoduje tworzenia próżni (wchodzenia powietrza pod szkiełko); w przeciwnym wypadku należy kontrolować wysychające preparaty (początkowo często, potem raz na kilka dni) i jeśli się tworzą pustki, to należy je wypełnić podaniem odpowiedniej ilości medium przy brzegu szkiełka; przy pomocy dwóch igieł preparacyjnych, pod mikroskopem stereoskopowym, cierpliwymi manipulacjami doprowadzić do wyduszenia powietrza i wprowadzenia medium
  • w skrajnych przypadkach - gdy przegapi się początek tworzenia próżni i pęcherz powietrza jest duży, wszedł w środkowe obszary preparatu, utracił łączność z brzegiem a medium jest już gęste, jedynym wyjściem może być zdjęcie szkiełka nakrywkowego, naniesienie medium i ponowne przykrycie
  • po stabilizacji (zgęstnieniu) medium, dla uzyskania (prawie) trwałego preparatu uszczelnia się brzegi szkiełka mikroskopowego lakierem do paznokci; lakier dobrze nanosi się końcówką wykałaczki; nie należy oszczędzać na szerokości strefy poza szkiełkiem nakrywkowym; lakier powinien też nieco (do 1mm) nachodzić na szkiełko nakrywkowe; przy krawędzi nakładać lakier grubo ("z górką") bo w czasie wysychania znacznie się skurczy i obniży; tylko w przypadku grubych lub mało wyschniętych preparatów trzeba stosować powtórne nakładanie lakieru - krawędź łączenia wyschniętego lakieru ze szkiełkiem nakrywkowym można skontrolować pod mikroskopem stereoskopowym
  • przed nasieniem lakieru dobrze jest mieć czystą powierzchnię szkiełka nakrywkowego (jeśli jest zabrudzona), potem jej czyszczenie jest kłopotliwe; do czyszczenia można użyć wacików-pałeczek do uszu, jedną stronę zwilżywszy etanolem wycieramy, drugą usuwany/dosuszamy powierzchnię; waciki traktujemy jednorazowo
  • doczyszczenie obszaru szkiełka przedmiotowego przy brzegu szkiełka nakrywkowego nie jest krytyczne; trzeba jedynie usunąć grubsze złogi przyschniętego medium przez ściągnięcie ich igłą preparacyjną
  • preparaty przechowujemy w odpowiednich pudełkach; oczywiście poziomo!

Inne media (uwagi):
  • woda - w przypadku wątrobowców prawie zawsze pożądane lub konieczne jest wykonanie przyżyciowej obserwacji komórek z uwagi na znaczenie diagnostyczne ciałek oleistych
  • glicerożelatyna - zaletą jest taniość i (po uszczelnieniu) znaczna trwałość oraz natychmiastowość wykonania (unika się pracochłonnego uzupełniania medium Hoyera w miarę jego wysychania); wadą ±brak prześwietlanie preparatu (można prześwietlić przed włożeniem) i pewna kłopotliwość wykonania samego preparatu (podgrzewany stolik do preparacji itp.); no i fenol ma przykry zapach
  • media typu syntetyczne żywice (DPX itp.) lub oparte na alkoholu poliwinylowym, dla preparatów "z wody" - brak osobistych doświadczeń, spotyka się relacje, że mają z upływem czasu skłonność do krystalizacji